Servei de Seqüenciació Sanger
Procés complet de seqüenciació Sanger realitzat pel Servei
Quan es vol seqüenciar una placa sencera de 96 mostres amb un mateix primer per totes les mostres, el servei ofereix la possibilitat de realitzar, de forma automatitzada i sense que l'usuari hagi d'intervenir, tot el procés descrit a continuació.
a) Quan es parteix de producte de PCR: clean-up del producte de PCR + reacció de seqüència + clean-up de la reacció de seqüència + carrera al seqüenciador.
b) Quan es parteix d'ADN de plàsmid purificat: reacció de seqüència + clean-up de la reacció de seqüència + carrera al seqüenciador.
En aquest cas, cal contactar amb nosaltres directament (genomica@upf.edu). Podeu consultar les tarifes aquí. L'usuari ens entrega el primer de seqüenciació de concentració coneguda i el rang estimat de concentració dels ADN o dels productes de PCR.
Procés de seqüenciació Sanger realitzat per l'usuari
Si el nombre de mostres és menor a 96 o l'usuari desitja realitzar els protocols ell mateix, cal seguir els passos descrits a continuació.
1.- Preparació de les mostres:
Si el material de partida és ADN amplificat amb PCR, recomanem confirmar la presència del producte de PCR amb una electroforesi en gel d'agarosa. En aquest cas, cal purificar el producte de PCR abans de realitzar la reacció de seqüenciació descrita a continuació. Nosaltres oferim el servei de purificació de producte de PCR per plaques de 96 mostres (consulteu tarifes).
En cas de partir d'ADN extret de plàsmids, no cal realitzar aquest pas de purificació i es pot realitzar directament la reacció de seqüenciació descrita a continuació.
1.1.- Reaccio de seqüència Protocol de la reacció de seqüència.
Fungible: Des del Servei proporcionem el Big Dye Terminador v3.1 i el Tampó de Seqüènciació (5X) associat.
1.2.- Clean-up de la seqüència (Protocol de neteja de la reacció de seqüència)
· Mostres en tubs:
Per un volum petit de mostres (menys de 50), prepareu les mostres en tubs ependorfs de 1.5ml.
Rotuleu els ependorfs amb el vostre codi d'usuari (4 digits) i el nom de la mostra.
Per agilitzar el processament de mostra, agraïm que el nom de la mostra sigui curt!
Desprès de dur a terme la reacció de seqüència i la neteja de la reacción de seqüència, porteu la mostra seca (sense resta d'etanol...) al Servei.
· Mostres en plaques:
Si teniu un mínim de 50 mostres, us recomanem preparar les vostres seqüències en plaques.
Aquest sistema presenta varis advantatges:
•L'automatizatció de la preparació de les mostres: Des del Servei oferim les aplicacions de purificació de PCR i la neteja de la reacció de seqüència
•Abaratiment del cost de les seqüències: El volum maxím de bigdye que es fa servir és de 1ul. Reacció Sequencia for the milipore clean-up method (protocol)
•Les seqüències surten més netes.
2-. Lliurament de mostres al Servei:
Les sol·licituds de seqüenciació es realitzaran ONLINE ( petició de seqüenciació ADN ). Es generarà una còpia que s'imprimirà, SIGNARÀ i es farà arribar al servei en el mateix moment de lliurar les mostres per al seu processament. No s'acceptarà cap petició que no s'hagi realitzat online.
Trobareu a l'entrada del Servei a la dreta un petit congelador destinat al stock de les mostres per seqüènciar i al costat una safata per deixar les vostres solicituds de seqüència.
3.- Lliurament de resultats de seqüenciació:
Una vegada processades les mostres, un responsable del servei es posarà en contacte amb l'usuari via correu electrònic i els fitxers de resultats generats són transferits a un servidor central accessible des de qualsevol ordinador.
Tots els fitxers de resultats transferit a aquest servidor s'ESBORREN automàticament cada diumenge. Si voleu recuperar dades de setmanes anteriors, no dubteu a demanar-ho al Servei per email.
Existeixen dos mètodes d'accés a les dades generades:
a) Els usuaris conectats a la xarxa UPF (Novel) poden recuperar els fitxers de resultats seguint el camí:
§ Mi PC �� Unitat P (Folders en "Cm-c1ed\Cmd") �� SCT �� Genòmica �� Sequenciacio
b) Usuaris no conectats a la xara UPF (Novel) podran accedir a les dades mitjaçant l'entorn web: Conectar amb el navegador web a la següent direcció: https://webfiles.upf.edu/NetStorage
Entrar el usuari: .sctweb.ext.cm.ed.upf i el password (demaneu-lo al Servei de Genòmica)
A l'esquerra en l'apartat de "carpetas", desplegueu les carpetes: NetStorage; Home@UPF ; Genomica i Sequenciacio
Descarregar i guardar els fitxers de resultats en el vostre equip