Genómica

Servicio de Secuenciación Sanger

Proceso completo de secuenciación Sanger realizado por el Servicio

Cuando se desea secuenciar una placa entera de 96 muestras con un mismo primer para todas las muestras, el servicio ofrece la posibilidad de realizar, de forma automatizada y sin que el usuario tenga que intervenir, todo el proceso descrito a continuación.

a)      Cuando se parte de producto de PCR: clean-up del producto de PCR + reacción de secuencia + clean-up de la reacción de secuencia + carrera en el secuenciador.

b)      Cuando se parte de ADN de plásmido purificado: reacción de secuencia + clean-up de la reacción de secuencia + carrera en el secuenciador.

En este caso, se debe contactar directamente con nosotros (genomica@upf.edu). Se pueden consultar las tarifas aquí. El usuario nos entrega el primer de secuenciación de concentración conocida y el rango estimado de concentración de los ADN o productos de PCR.

Si el número de muestras es menor a 96 o el usuario desea realizar los protocolos él/ella mismo/a, se deben seguir los pasos descritos a continuación.

1.-  Preparación de las muestras:

Si el material de partida es ADN amplificado con PCR, recomendamos confirmar la presencia de un único producto de PCR con una electroforesis en gel de agarosa. En este caso, es necesario purificar el producto de PCR antes de realizar la reacción de secuenciación descrita a continuación. Nosotros ofrecemos el servicio de purificación de producto de PCR para placas de 96 muestras (consultar tarifas).

En el caso de partir de ADN extraído de plásmidos, no hay que realizar este paso de purificación y se puede realizar directamente la reacción de secuenciación descrita a continuación.

1.1.-    Reacción de secuencia Protocolo de la reacción de secuencia

Fungible: Desde el Servicio proporcionamos Big Dye Terminador v3.1 y el Tampón de secuenciación (5x) associado.

1.2.-   Clean-up de la secuencia (Protocolo de clean-up de la reacción de secuencia 

·         Muestras en tubos:

Para volumenes de muestras pequeños (menos de 50), se recomienda preparar las muestras en tubos eppendorfs de 1.5 ml.

Rotular los eppendorfs con: vuestro código de usuario (4 dígitos) y el nombre de la muestra. Para agilizar el procesamiento de la muestra, agradecemos que el nombre sea corto.

Después de realizar la reacción de secuencia y la purificación de la reacción de secuencia, llevar la muestra seca (sin restos de etanol) al Servicio.

·         Muestras en placas:

Si tenéis un mínimo de 50 muestras, recomendamos preparar vuestras secuencias en placas. Este sistema presenta varias ventajas:

           • La automatización de la preparación de las muestras: desde el servicio ofrecemos las aplicaciones de purificación de PCR y de reacción de secuencia.

          • Abaratamento del coste de las secuencias:el volumen máximo de BigDye que se usa es de 1 ul para el clean-up de secuencia con Milipore (protocolo)

          • Las secuencias salen más limpias.

2.- Entrega de muestras al Servicio:

Las solicitudes de secuenciación se realizarán ONLINE (petición de secuenciación ADN). Se generará una copia que se imprimirá, FIRMARÁ y llevará al Servicio en el mismo momento de dar las muestras para su procesamiento. No se aceptará ninguna petición que no se haya realizado online.

3.- Entrega de resultados de secuenciación:

Cuando las muestras han sido procesadas, un responsable del Servicio se pone en contacto con el usuario via correo electrónico y los ficheros de resultados generados se transfieren a un servidor central acesible desde cualquier ordenador.

Todos los ficheros de resultados se BORRARAN automáticamente cada domingo. Si desean recuperar datos de semanas anteriores, no duden en pedirlos al Servicio por email.

Existen dos métodos de acceso a los datos generados:

a) Los usuarios conectados a la red UPF (Novel) pueden recuperar los ficheros de resultados siguiendo el camino:

§  Mi PC �� Unitat P (Folders en "Cm-c1ed\Cmd") �� SCT �� Genòmica �� Sequenciacio

b) El resto de usuarios pueden acceder a los datos a través del entorno web:

conectando con el navegador a la dirección

Entrar el usuario: .sctweb.ext.cm.ed.upf  y  el password (pedirlo al Servicio de Genómica)

A la izquieda en el apartado "carpetas", desplegar las carpetas : NetStorage; Home@UPF ; Genomica i Sequenciacio

Descargar y guardar los ficheros de resultados en vuestro equipo.